Malaria-related immunosuppression in vaccinology, a new immunological perspective

Abstract

Malaria ist mit etwa 200 Millionen Fällen und 610,000 Toten pro Jahr eine der weltweit wichtigsten Infektionskrankheiten. Die Möglichkeiten zur Kontrolle der potentiell tödlichen Spezies Plasmodium falciparum (Pf) scheinen ausgeschöpft zu sein, weshalb so schnell wie möglich ein wirksamer Malaria-Impfstoff entwickelt werden sollte. Die Bemühungen um die Entwicklung wirksamer Impfstoffe zur Prävention der Malaria erstrecken sich über mehr als sechs Jahrzehnte. Es scheint, dass es in endemischen Gebieten eine Hyporesponsivität gibt, die es genauer aufzuschlüsseln gilt. Jedoch steht bisher noch kein wirksamer Impfstoff zur Verfügung. Die Komplexität des Parasiten und sein Lebenszyklus machen es zu einer besonderen Herausforderung einen Impfstoff zu entwickeln. Die vorhandene Semiimmunität der Menschen in malariaendemischen Gebieten oder auch aktive Infektionen scheinen die Impfantwort zu stören.

Die vielversprechendsten Impfstoffkandidaten sind heute die Impfstoffansätze mit lebenden Parasiten, die bei malaria-naiven Probanden einen sterilen Schutz gegen Malaria hervorrufen können. Seit die Produktion von Sporozoiten als Impfstoff für die Anwendung beim Menschen möglich geworden ist, ist die traditionelle Impfung mit ganzen lebenden Mikroorganismen gegen Malaria machbar und vielversprechend geworden.

Die intravenöse Injektion von abgeschwächten (attenuierten) Sporozoiten kann zu einem sterilen Schutz vor einer späteren Infektion für mehrere Monate führen, der mit der sogenannten kontrollierten Infektion (controlled human malaria infection – CHMI) überprüft werden kann. Bei dieser Art des Wirksamkeitsnachweis für Impfstoffe wird ein nicht abgeschwächter Parasit nach Immunisierung inokuliert. In einer im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Studie bewirkte die Immunisierung durch Injektion von Sporozoiten, die durch die gleichzeitige Gabe von Atovaquon/Proguanil (A/P) abgeschwächt wurden, bei vier von 18 Teilnehmern einen sterilen Schutz. A/P ist ein zugelassenes Medikament, dass bereits gegen die Leberstadien des Parasiten wirkt. Im Vergleich zu Studien bei denen die Attenuierung später erfolgt zeigt sich, dass der Immunschutz umso wirksamer zu sein scheint, je länger der Parasit im Leberstadium sich noch vermehren kann. A/P hat sich somit nicht als sinnvolles Medikament für die Chemoattenuierung bewährt.

In ähnlicher Weise führte eine dreimalige Anwendung von strahlenabgeschwächten Parasiten zum Schutz von mindestens 75 % der Teilnehmer, die eine Infektion nach dem CHMI-Modell erhielten, indem homologe oder heterologe, voll infektiöse Parasiten verwendet wurden. Die Verabreichung von 9x 105 strahlengeschwächten Pf-Sporozoiten an Tag 1, Tag 8 und Tag 29 bot einen besseren Schutz als die Verkürzung der Verabreichung auf nur zwei Tage (Tag 1 und Tag 8).

Verglichen mit malaria-naiven Populationen sind die humoralen und zellulären Immunantworten auf Impfstoffen oft vermindert, wenn dieselben Impfstoffe und Impfschemata in Malaria-Endemiegebieten angewendet werden. Der supprimierte Immunstatus bei Personen mit chronischen Pf Infektionen spiegelt sich im Immunprofil der regulatorischen Zellen wider. Die am häufigsten beschriebenen immunsuppressiven Zellen während der Entwicklung des Malaria-Blutstadiums sind die regulatorischen T-Zellen (Treg). Der Malaria-Wirt besitzt jedoch auch andere regulatorische Zellen, die unterschiedliche humorale und zelluläre Antwortprozesse verfolgen. Dazu gehören unter anderem myeloide Suppressorzellen (MDSC). Diese können verschiedene Immunprozesse im Körper regulieren und finden sich bei pathologischen Situationen wie chronischen Infektionen häufig in erhöhter Anzahl in der Blutzirkulation.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es bei CHMI zu einem signifikanten Anstieg der zirkulierenden MDSC beim Auftreten von Malariaparasiten im Blutstadium kommt. Die MDSC-Population konnte die Proliferation von CD4 und CD8 T Lymphozyten um etwa 50% verringern.

Zusätzlich zu der Schwierigkeit einen Impfstoff zu entwickeln, der vor einer so komplexen Infektion wie Malaria schützt, besteht die Möglichkeit adjuvanter Maßnahmen. Zu diesen könnte beispielsweise auch eine vorbereitende Veränderung des Immunstatus durch Chemotherapie chronischer Infektionen gehören. Die Entdeckung der MDSC zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion könnte als Grundlage für die Erforschung ihrer Rolle bei der natürlich erworbenen Immunität während Malariainfektionen in endemischen Gebieten und für die Untersuchung ihres konkreten Beitrags zur Immunsuppression auch in anderen Zusammenhängen dienen. Es besteht die Möglichkeit Anzahl und Aktivität der MDSC zu verändern, was als Ergänzung zu Impfprotokollen in Betracht gezogen werden kann.

Um die Parasitenexposition festzustellen, könnte der Diagnostische Schnelltest (Rapid Diagnostic Test – RDT) ein wertvolles Instrument sein, das durch Biomarker wie das Histidin-reiche Protein-2 (HRP2) des Parasiten identifiziert wird. Von diesem Protein wurde mehrfach in Fachartikeln berichtet, dass es auch lange nach der Therapie im Blut verbleibt. Hier haben wir festgestellt, dass die Halbwertszeit von HRP2 bisher unterschätzt wurde und nicht wie bisher berichtet zwei bis drei Tage, sondern neun Tage beträgt. Diese lange Halbwertszeit erklärt die Falsch-Positiv-Rate von RDTs, insbesondere in hochgradig endemischen Gebieten. HRP2 kann sich bei ständiger Exposition oder bei wiederholten, zeitlich nahen Infektionen akkumulieren. Es besteht die Möglichkeit, RDTs als neues Instrument zu verwenden, um die Exposition von Personen gegenüber dem Parasiten zu erfassen.

Die initiale Eliminierung von Parasiten vor der Impfung kann dazu beitragen, einen gesunden Immunstatus zu schaffen, der wiederum eine bessere Reaktion auf den Impfstoff begünstigen kann.

Mit dieser Dissertation wird versucht, einige dieser Hindernisse zu überwinden, indem sie das Wissen über die malariabedingte Immunsuppression erweitert und Wege zur Förderung der Entwicklung einer wirksam, dauerhaft und effizient schützenden Immunität vorschlägt. Zusätzlich wird ein neues Eliminationsmodell von HRP2 für die Auswertung des RDT in der direkten Anwendung vor Ort eingesetzt.

Malaria is still a major contributor to the global burden of infectious disease, with about 200 million cases and 610,000 deaths annually. The success of implemented measures applied to control Plasmodium falciparum (Pf) is limited and finding an effective malaria vaccine as soon as possible may enable highly efficient control or even elimination campaigns. Although efforts to develop effective vaccines have spanned more than six decades. Reportedly, there is a hyporesponse in endemic areas that needs to be further broken down in detail. The complexity of the parasite with well-differentiated stages poses major obstacles to the development of a protective vaccine. In addition, the immune status of people at the highest risk of malaria does not help promote a protective response. The existing semi-immunity of people in malaria-endemic areas or during active infections appears to interfere with the vaccine response.

The most promising vaccine candidates today are based on whole live parasite vaccine approaches, which can confer sterile protection against controlled human malaria infections (CHMI) in malaria-naïve subjects. The traditional vaccination with whole living microorganisms has become feasible against malaria through the promising vaccine approach using attenuated whole parasites. It has gone from being a proof-of-concept to a tangible medicinal product since it became possible to manufacture sporozoites in an aseptic and purified form.

The intravenous injection of high numbers of attenuated sporozoites results in sterile protection from a subsequent infection for at least a few months. CHMI studies serve as a proof-of-concept for vaccine efficacy. Here, the same product that is used for immunization but without attenuation is used to test vaccine efficacy in a controlled environment. In a study that forms part of this thesis, immunization by injection of sporozoites attenuated by concomitant administration of atovaquone/proguanil (A/P) led to sterile protection in 4 of 18 participants. A/P is active against asexual blood but also liver stage parasites. Comparison with similar studies that used drugs that allow full liver stage maturation, such as chloroquine, suggests that the longer the parasite develops during the liver stage, the more efficient the immune protection is. Thus, A/P has not proven to be a useful drug for chemoattenuation.

In the same fashion, a regimen of 3 doses of radiation-attenuated parasites led to the protection of at least 75% of the participants receiving CHMI by using homologous or heterologous fully infectious parasites. Human administrations of 9x 105 radiation-attenuated Pf sporozoites on day 1, day 8, and day 29 conferred better protection than shortening the regimen to only two days (day 1 and day 8).

Compared to malaria-naïve populations, humoral and cellular responses to vaccination are often reduced when the same vaccines and regimens are employed in malaria-endemic settings. The suppressed immune status in subjects with Pf malaria, including chronic, asymptomatic infections, is reflected by a regulatory cell immune profile. The best-studied immunosuppressive cells during malaria are the regulatory T cells (Treg), but also other potent regulatory cells exist and may play an even more important role.

Myeloid-derived suppressor cells (MDSC) are such a cell type. They regulate various immune processes in the host and increase in numbers in many pathologic states, including chronic infections. During a CHMI, we observed a significant increase in circulating MDSC at the onset of asexual blood stage parasitemia. Ex vivo, those MDSCs were able to reduce the proliferation of CD4 and CD8 T lymphocytes by approximately 50%.

Apart from the difficulty of discovering and developing a vaccine that protects against an infection of such a complex nature as malaria, the immune status of the vaccine recipients plays an important role in the generation of an effective vaccine. The discovery of MDSC in early and very light infections will serve as a basis for the study of their relevance in naturally acquired and vaccine-induced immunity to malaria in malaria-endemic areas. It will be highly interesting to study their relative contribution to immunosuppression, as well as to develop methods to decrease the presence and activity of MDSCs and to study their kinetics when pretreatment with antimalarials is applied even in asymptomatic subjects.

To discern parasite exposure, the Rapid Diagnostic Test (RDT) could be a valuable tool, monitored by biomarkers such as the histidine-rich protein-2 (HRP2) of the parasite. This protein has repeatedly reported long persistence in blood long after treatment. Here, we have determined that the half-life of HRP2 was underestimated so far and is not 2-3 days as previously reported, but 9 days. This long half-life explains the false positive rate of RDTs, especially in highly endemic areas. HRP2 can accumulate under constant exposure or by repetitive infections close in time. There is the possibility of using RDTS as a new tool to reflect the extension of exposure of individuals to the parasite.

A preliminary parasite clearance phase prior to vaccination can contribute to establishing a healthy immune status that may favor a better response to the vaccine.

In an attempt to address some of these hurdles, this dissertation aims to revive and improve the knowledge on malaria-related immunosuppression and propose ways to increment the generation of an effective, long-lasting, and efficient protective immunity. Additionally, contributes with a new elimination model of HRP2 for the interpretation of the RDTs on the field.