Molekulare Analyse möglicher Interaktionspartner von SLy1

Abstract

Sowohl der IL-7R Signalweg, als auch der p53 Signalweg sind essentiell für die Entwicklung der Thymozyten. NPM1 ist in der Lage, die Expression bzw. Aktivierung von sowohl STAT5, als auch von p53 zu beeinflussen und steht somit im Mittelpunkt des Crosstalks des IL-7R-STAT5 und des p53 Signalweges. In SLy1-defizienten Thymozyten ist der pro-tropische IL-7R-Signalweg hochreguliert. Unerwarteterweise führt dies nicht über den Crosstalk mit NPM1 zu niedrigen p53 Leveln. Stattdessen werden in SLy1-defizienten Thymozyten erhöhte p53 Level einhergehend mit einer erhöhten Apoptoserate detektiert. Mittels Western Blot Analyse von Immunopräzipitationen wurden Interaktionen des STAT5-p53 Crosstalks zunächst in HEK 293T Zellen bestätigt. In der T-ALL Zelllinie Loucy als Modell für humane Thymozyten konnte anschließend die Interaktion p53-Mdm2 und Bard1-NPM1 nachgewiesen werden. Immunopräzipitationen mittels SLy1-AK ergaben Hinweise auf Interaktionen zwischen SLy1 und STAT5 sowie von SLy1 und NPM1. Es kann damit bestätigt werden, dass SLy1 über direkte Interaktionen in den STAT5-p53 Crosstalk eingreift. FOXO1 ist in reifen Thymozyten ebenfalls in der Lage in den IL-7R Signalweg einzugreifen. Mittels Western Blot Analyse von Immunopräzipitationen konnten Belege für eine direkte Interaktion zwischen SLy1 und FOXO1 im überexprimierten Zustand in HEK 293T Zellen gefunden werden. Die Analyse der pSLy1-Immunopräzipitation mittels Massenspektrometrie lieferte zahlreiche Ansatzpunkte für die Suche nach weiteren Interaktionspartner. Die Nutzung der T-ALL Zelllinie Loucy für die Interaktionspartneranalyse bietet die Möglichkeit neben der Thymozytenentwicklung auch neue Erkenntnisse über die Rolle von SLy1 in der Leukämieentstehung zu gewinnen. Zur Analyse der Funktion von SLy1 in einer T-ALL Zelllinie wurden zudem Jurkat SLy1 Knockdown (KD) Zelllinien hergestellt und der Effekt auf Proteinlevel und Interaktionsmuster im STAT5-p53 Crosstalk untersucht. Dabei scheint SLy1 zumindest in Jurkat Zellen in diesem Signalweg keine aktive Rolle zu spielen. Dennoch kann die vorliegende Arbeit eine Funktion von SLy1 im STAT5-p53 Crosstalk durch den Nachweis der direkten Interaktionen von SLy1 mit STAT5 und mit NPM1 in der T-ALL Zelllinie Loucy bestätigen.