Etablierung einer quantitativen Echtzeit-PCR-basierten Methode zur Detektion inflammatorischer Reaktionen während der Hämokompatibilitätsprüfung verschiedener Testmaterialien

Abstract

Vor dem Hintergrund der zunehmenden Inzidenz von Systemerkrankungen mit kardiovaskulärer Komponente gewinnen neuartige Biomaterialien synthetischer oder biologischer Herkunft zunehmend an Bedeutung. So wächst ihr Bedarf im klinischen Anwendungsfeld sowie die Erforschung ihrer Einsetzbarkeit als Medizinprodukt stetig. Damit ist es essenziell, dass sie sich in ihre Umgebung integrieren können, ohne unerwünschte Wechselwirkungen mit den physiologisch ablaufenden Stoffwechselprozessen einzugehen. Um diese Effekte bei der Wechselwirkung von Blut mit Fremdoberflächen eingehender studieren zu können, lag das Ziel dieser Arbeit in der Etablierung einer Untersuchungsmethode zum Nachweis des immunaktivierenden Potenzials dieser Biomaterialien anhand ausgewählter Signaturgene. Anhand dieser Werte sollte gezeigt werden, welche Zytokine durch welches Implantatmaterial oder bioaktive Beschichtung verstärkt ausgeschüttet werden. Auf diese Weise sollte somit ein Testablauf entwickelt werden, der ergänzend zur herkömmlichen Hämokompatibilitätsprüfung eine Aktivierung des Immunsystems auf molekulargenetischer Ebene detektierbar machen sollte. Um eine Aussage zur Genexpression der zehn ausgewählten Genmarker CCL-2, ICAM- 1, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-8, TGF-β und TNF-α zu treffen, wurden diese mit der Methode der Real-time-qPCR analysiert. Dazu sollten im humanen Vollblut und PBMC unabhängig voneinander nachgewiesen und quantifiziert: Nach der Inkubation mit den ausgesuchten Probematerialien Titan, PVC, Cas9-mRNA und Lugdunin in zwei in- vitro-Inkubationsmodellen wurden die Genexpression ausgewählter, in der Forschung etablierter Immunmarker in humanem Vollblut und von mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMCs) gegenübergestellt. Durch dieses Procedere sollte somit untersucht werden, ob es für eine aussagekräftige Analyse ausreichend ist, die Testmaterialien im Vollblut zu inkubieren oder ob nur eine Testung mit isolierten PBMCs einen zusätzlichen Erkenntnisgewinn zur Immunmarkerexpression bei Materialkontakt liefern könne. In diesem Zusammenhang konnten die vorgestellten Ergebnisse in den beiden Zellgruppen zeigen, dass sowohl Art als auch Herkunft der Zellen sowie ihr Ansprechen auf Materialkontakt durch endogene Stimuli den Grad der Ausschüttung einzelner Immunmarkern entscheidend beeinflusste. Eine der gesetzlich vorgeschriebenen Qualitätskontrollen von Medizinprodukten, die Hämokompatibilitätsprüfung, wurde auch im Rahmen der hier vorgestellten Dissertation durchgeführt. Hierbei wurde die Verträglichkeit der biologischen und synthetischen Fremdstoffen- und -oberflächen mit dem Vollblut und dessen Zellen mit den analysiert. Insgesamt ließ sich aus den Resultaten dieser Analysen keine generelle Empfehlung für die Überlegenheit einer Vollblut- oder PBMC-Zellreihe für die Analyse des Immunaktivierungspotenzials blutkontaktierender Materialien ableiten. Die zusätzliche Optimierung des Milieus für das Testmaterial durch die Isolation der immunaktiven PBMCs brachte lediglich für einzelne Immunmarkern einen zusätzlichen Erkenntnisgewinn und zeigte vielversprechende Ergebnisse in Abhängigkeit von der jeweiligen Zellpopulation: Hierzu zählte die Expression von CCL-2 aus den PBMCs nach Kontakt zur synthetischen mRNA, wohingegen sich IL-8 als ein potenter Marker nach Polymer-Kontakt in den Vollblutzellen erwies. Die stetige Verbesserung und Anpassung von blutkontaktierenden Materialien und deren Analysemethoden an ihren Einsatz als medizinische Testmaterialien bleibt somit ein ebenso vielschichtiger und wie dynamischer Prozess, welcher weiterhin umfassender Forschung zum tieferen Verständnis der Biokompatibilität und Immunaktivierung bedarf. Eine Analyse mit bisher nur gering in Studien repräsentierten Zytokin-Subtypen kann das Spektrum dieser Grundlagenforschung zusätzlich erweitern. In diesem Zusammenhang empfiehlt sich eine Ergänzung der herkömmlichen Prüfung zur Hämokompatibilität um den anschließenden Nachweis des Immunaktivierungspotenzials durch die RT-qPCR.