Expanding the Genetic Toolbox for Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH

Abstract

Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH is a thermophilic, methanogenic archaeon that grows with hydrogen as the sole electron and carbon dioxide as the sole carbon source. Due to its fast and robust growth, M. thermautotrophicus ΔH has been a model microbe for hydrogenotrophic methanogenesis for decades. Recently, there has been increased commercial interest in M. thermautotrophicus ΔH in industrial biomethanation due to its high methane production rates. However, a lack of genetic tools hindered further basic research and industrial applications for a long time. The first genetic system for M. thermautotrophicus ΔH was recently established (Fink et al. 2021). While this was a significant step for research with M. thermautotrophicus ΔH and methanogens in general, additional genetic tools are required to fully unlock the potential of the genetic system. In this study, we present important additions to the genetic toolbox for M. thermautotrophicus ΔH. So far, the only selection marker was a thermostable neomycin resistance cassette. We investigated several potential selection markers based on mupirocin resistance, puromycin resistance, and formate prototrophy. We could show that the formate dehydrogenase (fdh) operon from M. thermautotrophicus Z-245 enables M. thermautotrophicus ΔH to utilize formate as an alternative growth substrate. Also, we could show that this can be directly used to select recombinant cells based on their formate prototrophy, thus establishing the fdh operon as the second selection marker and as the first one with no spontaneous growth of wild-type cells under selection pressure. In addition, we also investigated alternative transformation methods. Previously, M. thermautotrophicus ΔH was only transformable via conjugation. Here, we expanded the available transformation methods by establishing an electroporation protocol. Furthermore, we investigated tools for genome editing. Until now, all genome editing in M. thermautotrophicus ΔH was based on homologous recombination. We established a CRISPR system based on a thermostable Cas9 (ThermoCas9) and could show that this system is suitable for traceless genome editing in M. thermautotrophicus ΔH.

Dissertation ist gesperrt bis zum 15. September 2026 !

Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH ist ein thermophiles, methanogenes Archaeon, welches mit Wasserstoff als einziger Elektronenquelle und Kohlenstoffdi-oxid als einziger Kohlenstoffquelle wächst. Aufgrund seines schnellen und robusten Wachstums ist M. thermautotrophicus ΔH seit Jahrzehnten ein Modelorganismus für hydrogenotrophe Methanogenese. In jüngster Zeit gibt es auch ein verstärktes wirtschaftliches Interesse an M. thermautotrophicus ΔH für die industrielle Biomethanisierung aufgrund seiner hohen Methanproduktionsraten. Weitere Grundlagenforschung und industrielle Anwendungen wurden für lange Zeit durch das Fehlen genetischer Werkzeuge verhindert. Das erste genetische System für M. thermautotrophicus ΔH wurde jüngst entwickelt (Fink et al. 2021). Dies war ein signifikanter Schritt für die Forschung mit M. thermautotrophicus ΔH und Methanogenen im Allgemeinen, jedoch sind weitere genetische Werkzeuge vonnöten, um das volle Potential des genetischen Systems auszuschöpfen. In dieser Arbeit präsentieren wir wichtige Ergänzungen zum genetischen Werkzeug-kasten für M. thermautotrophicus ΔH. Wir haben mehrere potenzielle Selektions-marker, basierend auf Mupirocinresistenz, Puromycinresistenz und Formiatproto-trophie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das Formiatdehydrogenase (fdh) Operon aus M. thermautotrophicus Z-245 das Wachstum von M. thermautotrophicus ΔH mit Formiat als alternativem Substrat ermöglicht. Diese Eigenschaft kann auch verwendet werden, um rekombinante Zellen direkt aufgrund ihrer Formiatprototrophie zu selektionieren. Damit ist das fdh Operon der zweite Selektionsmarker überhaupt und der erste Selektionsmarker ohne Wachstum von spontanresistenten Wildtyp-Zellen. Zusätzlich untersuchten wir alternative Transformationsmethoden. Zuvor war M. thermautotrophicus ΔH nur durch Konjugation transformierbar. Hier konnten wir Elektroporation als alternative Transformationsmethode etablieren. Außerdem haben wir Werkzeuge zur Genomeditierung untersucht. Bis jetzt basierten alle Genomeditierungen in M. thermautotrophicus ΔH auf homologer Rekombination. Wir etablierten ein CRISPR-System basierend auf einer thermostabilen Cas9 (ThermoCas9) und konnten zeigen, dass dieses System für markerlose Genomeditierungen in M. thermautotrophicus ΔH geeignet ist.