Spatial Immuno-Oncological Profiling of Cancer Using Multiplexed Tissue Imaging

Abstract

Dissertation gesperrt bis zum 27.11.2027!

Tumorentwicklung und -progression werden nicht nur durch die intrinsischen Eigenschaften maligner Zellen bestimmt, sondern maßgeblich durch ihre komplexe, räumlich organisierte Interaktion mit dem umliegenden Tumormikromilieu moduliert. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich eine hochdimensionale Bildgebungsplattform auf Basis der MACSima imaging cyclic staining (MICS) Technolgie etabliert und weiterentwickelt, die eine tiefgehende Immunphänotypisierung von Tumorgewebe auf Einzelzellebene ermöglicht. Durch die Entwicklung und Validierung eines Panels mit mehr als 121 Markern sowie die Optimierung von Analyseworkflows konnte die Plattform erfolgreich beim hepatozellulären Karzinom (HCC) eingesetzt werden, wodurch räumlich strukturierte immunsuppressive Nischen identifiziert wurden. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Plattform für die Analyse von Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Proben des seltenen und aggressiven NUT-Karzinoms (NCs) adaptiert, welches durch Genfusionen des NUTM1-Gens charakterisiert ist. Aufgrund der Seltenheit des NCs ist das Probenmaterial begrenzt und meist auf FFPE-Gewebe beschränkt. Es wurde eine Kohorte mit 16 Tumorproben von 14 Patient*innen zusammengestellt und eine hochaufgelöste räumliche Einzelzellanalyse auf Proteinebene durchgeführt. Ergänzt durch Immunhistochemie (IHC), Sequenzierungsverfahren und Durchflusszytometrie wurde eine der bislang umfassendsten molekularen Charakterisierungen dieser seltenen Malignität auf DNA-, RNA- und Proteinebene erzielt. Die Ergebnisse zeigten eine ausgeprägte Heterogenität des Tumorimmunmikromilieus, einschließlich „heißer“ (immuninfiltrierter) und „kalter“ (immunexkludierter) Tumorphänotypen, sowie immunregulatorische Interaktionen zwischen myeloiden Suppressorzellen (MDSCs) und CD8+ T-Zellen. Darüber hinaus konnte mittels multi-omic Analysen das Immuncheckpoint-Molekül CD276 als konsistent überexprimiertes und therapeutisch relevantes Ziel identifiziert und funktionell in vitro und in Xenotransplantationsmodellen validiert werden. Diese Arbeit zeigt die technische Realisierbarkeit und den biologischen Erkenntnisgewinn räumlicher Einzelzellanalysen in häufig auftretenden als auch in seltenen Tumoren auf und liefert neue Ansätze für das Verständnis und die Therapie des NUT-Karzinoms. Die hier entwickelte Plattform bietet eine skalierbare Grundlage für zukünftige Anwendungen raumbezogener Analysen in der Krebsforschung und soll einen Beitrag zur personalisierten Onkologie leisten.

Tumor development and progression are shaped not only by the intrinsic properties of malignant cells but also by their complex and spatially organized interactions with the surrounding microenvironment. In this thesis, I established and advanced a high-dimensional imaging platform based on the MACSima imaging cyclic staining (MICS) technology for deep immune profiling of tumor tissue. By designing and validating a panel comprising over 121 markers and optimizing imaging and analysis workflows, we successfully applied the platform to hepatocellular carcinoma (HCC), uncovering spatially structured immunosuppressive niches.

Building on this foundation, the platform was adapted to study formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples of NUT carcinoma (NC), a rare and aggressive cancer driven by chromosomal rearrangements involving the NUTM1 gene. Due to the rarity of NC, tissue samples are scarce and often limited to FFPE material. A cohort comprising 16 tumor specimens from 14 patients was assembled, and a highly detailed spatial single-cell proteomics analysis of NC was performed. In addition, complementary technologies including immunohistochemistry (IHC), whole-genome sequencing (WGS) and RNA-sequencing (RNA-Seq), and flow cytometry were employed, enabling one of the most comprehensive molecular characterizations of this rare malignancy to date across the DNA, RNA, and protein levels. The data revealed significant heterogeneity within the tumor immune microenvironment (TIME), including “hot” immune-infiltrated and “cold” immune-excluded phenotypes, as well as immunoregulatory interactions between myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and CD8+ T cells. Furthermore, multi-omic profiling identified the immune checkpoint molecule CD276 as a consistently overexpressed and actionable therapeutic target in NUT carcinoma (NC), which was validated functionally, both in vitro and in xenograft models.

Overall, this work demonstrates the feasibility and value of spatial single-cell profiling in prevalent and rare cancers and provides novel biological insights and therapeutic implications for NC. This thesis presents a flexible and scalable framework for deep spatial tissue analysis, advancing the field of spatially resolved cancer research. By enabling comprehensive characterization of tumor ecosystems, it aims to support translational efforts and guide the development of future therapeutic strategies.