Inhaltszusammenfassung:
Der Plexus choroideus ist ein Gewebe in den Ventrikeln des inneren Liquorsystems des Gehirns, dessen zentrale Aufgaben die Produktion von Liquor und der Aufbau der Blut-Liquor-Schranke sind. Mit der Entdeckung, dass Liquor über den perivaskulären Raum mit dem Interstitium des Gehirnparenchyms kommuniziert und so zur Beseitigung von Abfallprodukten aus dem Gehirn beiträgt, erhielt das Liquorsystem eine neue Relevanz, da Ablagerungen im Gehirn zu dessen Funktionsverlust führen und ein zentrales Merkmal vieler neurodegenerativer Erkrankungen, wie z.B. der Alzheimer-Krankheit, sind. Da Lymphgefäße im Gehirn fehlen und diese Drainagefunktion dort von Gliazellen übernommen wird, insbesondere durch Kanalproteine wie dem Wasserkanal Aquaporin-4 (AQP4), entstand die neue Bezeichnung „glymphatisches“ System. Ziel dieser Arbeit war es, humanen Plexus choroideus weiter zu charakterisieren und ein in vitro Modell zu etablieren, um Regulationsmechanismen der Liquorproduktion untersuchen zu können. Während es etliche Primärkulturmodelle, Zelllinien und 3D-Kulturmodelle von verschiedenen Tierarten gibt, sind menschliche Plexus choroideus Kulturmodelle, mit Ausnahme einiger weniger Studien an Zelllinien und Organoiden, kaum verfügbar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Primärkulturmodelle für humane Plexus choroideus Epithelzellen etabliert, die neue Möglichkeiten für Studien in einem näher an der menschlichen Realität liegenden System bieten. Dafür wurde das Wachstum humaner Plexus choroideus Epithelzellen aus dem Gehirn von Körperspendern unter verschiedenen Kulturbedingungen untersucht. Die Kulturen zeigten optimales Wachstum in serumhaltigem Medium. Die Behandlung mit Cytarabin (AraC) inhibierte das Wachstum von Fibroblasten und Makrophagen, wohingegen der Zusatz von Wachstumsfaktoren keinen sichtbaren Effekt zeigte. Explantatkulturen wiesen in den meisten Regionen einen guten Gewebeerhalt auf und bewahrten eine ähnliche Proteinexpression wie die des nativen Gewebes. In Dissoziationskulturen zeigten Zellen die spezifische Proteinexpression von Plexus choroideus Epithelzellen und entwickelten morphologische Charakteristika von Epithelzellkulturen. Die Dissoziationskulturen wurden parallel auf Laminin- und Kollagenbeschichtung kultiviert und wiesen Unterschiede in Wachstum und Morphologie, nicht jedoch in den Expressionsmustern der untersuchten Proteine auf. Die humanen Plexus choroideus Primärkulturen konnten bis zu sechs Mal passagiert werden und zeigten selbst nach Kryokonservierung bei -80ºC Proliferationsfähigkeit. Obwohl der Zugang zu menschlichem Körperspendergewebe begrenzt ist und sowohl das Alter als auch das post-mortem Intervall variiert, sind diese humanen Plexus choroideus Primärkulturmodelle ein wichtiges Werkzeug für zukünftige Studien im Bereich der Liquor- und Blut-Hirn-Schrankenforschung.
AQP4 ist das wichtigste Wasserkanalprotein des Gehirns und hat große Bedeutung für den Wasserhaushalt und somit auch die Funktionalität des Gehirns. Die jüngste Entdeckung von Deffner et. al., dass AQP4 in manchen Plexus choroideus Epithelzellen des humanen Gehirns exprimiert wird, wirft Fragen über die Regulation und Funktionalität der AQP4 Expression in diesen Zellen auf. Die Regulation von AQP4 ist bis heute nicht vollständig verstanden und umfasst verschiedene Aspekte, von denen wir uns in dieser Studie auf zwei konzentriert haben: die Bedeutung des Dystrophin-Glykoprotein-Komplexes im Bereich des Plexus choroideus und den Einfluss von hypoxischen Bedingungen in kultivierten Epithelzellen. Studien haben gezeigt, dass spezifische Komponenten der Basallamina die AQP4 Expression beeinflussen, indem sie mit dem Dystrophin-Glykoprotein-Komplex interagieren. Um zu untersuchen, ob dieser Regulationsmechanismus auch für die AQP4 Expression in humanen Plexus choroideus Epithelzellen gilt, wurde die AQP4 Expression auf Laminin, eine Basallamina Komponente, die mit dem Dystrophin-Glykoprotein-Komplex interagiert, mit der auf Kollagen, einer Komponente, für die keine solche Interaktion bekannt ist, in den neu etablierten Kulturen verglichen. Zusätzlich wurden die Expressionsmuster von AQP4 und Laminin, sowie von Proteinen des Dystrophin-Glykoprotein-Komplexes auf fixiertem Plexus choroideus Gewebe verglichen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Regulation von AQP4 in humanen Plexus choroideus Epithelzellen unabhängig von dessen Interaktion mit dem Dystrophin-Glykoprotein Komplex und der Basallamina ist.
Da vor kurzem gezeigt wurde, dass hypoxische Bedingungen in Mäusen eine AQP4 Produktion in Plexus choroideus Epithelzellen auslösen, setzten wir die humanen Plexus choroideus Kulturen solchen Bedingungen aus und verglichen die AQP4 Expression mit einer Kontrollgruppe. Interessanterweise zeigten die unter hypoxischen Bedingungen kultivierten Explantatstücke in vielen Regionen ein sehr stark positives Immunofluoreszenzsignal. Um ausschließlich das spezifische Signal in Plexus choroideus Epithelzellen zu bewerten, wurden Zellzählungen durchgeführt. Dabei wurde in verschiedenen zufällig ausgewählten Regionen der Prozentsatz an AQP4-positiven Epithelzellen pro Gesamtzahl der Epithelzellen ermittelt. Die Ergebnisse deuteten auf einen Stimulationseffekt nach 5 Tagen Hypoxie Behandlung hin. Die Wiederholung des Experiments mit Kulturen eines anderen Körperspenders ergab jedoch insgesamt keinen statistisch signifikanten Unterschied. Weitere Experimente sind notwendig, um einen Effekt der Hypoxiebehandlung auf die AQP4-Expression nachzuweisen oder zu widerlegen.
In einer erweiterten histologischen Charakterisierung des humanen Plexus choroideus wurde dessen Übergangszone zum Gehirnparenchym, welche auch als Taenia choroidea bezeichnet wird, untersucht. Diese Region ist von besonderem Interesse, da im Stroma des Plexus choroideus die Blut-Hirn-Schranke unterbrochen ist und somit an dieser Stelle eine mögliche Eintrittspforte von Wasser aber auch von Erregern in das Gehirnparenchym besteht. Interessanterweise beobachteten wir, dass Astrozyten in der Übergangszone eine veränderte Expression von AQP4 und dem Dystrophin-Glykoprotein Komplex aufwiesen. Die sehr starke und unpolare Expression von AQP4 an dieser Stelle lässt vermuten, dass Astrozyten in dieser Region eine wichtige resorptive und damit schrankenähnliche Funktion für die Wasser-Homöostase und -drainage im Sinne des glymphatischen Systems einnehmen könnten.
Erkenntnisse über die AQP4 Expression und Regulation in humanem Plexus choroideus und dessen Übergangszone können einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des Reinigungssystems des Gehirns und damit zum Verständnis des Pathomechanismus neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer- Krankheit leisten.
Abstract:
The CSF system has recently gained increased attention as an important part of the brain’s clearance and water homeostasis system. This is referred to as the glymphatic pathway theory and has been suggested to involve the water channel AQP4 and to be an important component in understanding the pathogenesis of neurodegenerative diseases. CP culture models are a valuable tool for investigating the regulation and production of CSF, as well as for BCSFB studies. Although many primary culture models, cell lines and 3D culture models exist from different animal species, human CP culture models are not readily available except for a few studies on cell lines and organoids. In this study, we have successfully established two primary CP culture models from human body donors, providing new opportunities to perform studies in a less artificial system. Human primary CP cultures showed optimal growth in serum-supplemented medium conditions and benefited from the use of AraC to suppress fibroblast and macrophage subcultures. The addition of growth factors had no apparent effect and was not pursued in this study. Tissue integrity was maintained in most explant cultures throughout the cultivation period, with positive immunofluorescence signals for CPEC-typical proteins. Nevertheless, alterations in the expression patterns were observed, indicating a loss of polarization. Human primary dissociation cultures were identified as epithelial, showing positive immunofluorescence signals for CPEC-typical proteins. The cultures were cultivated on both laminin and collagen coatings exhibiting differences in growth and morphology but showing similar protein expression patterns. Cultures could be passaged up to 6 times and proliferative capacity was restored after cryopreservation at -80ºC. Although access to human body donor tissue is limited and varies in post mortem time and age, we suggest these cultures to be a valuable tool for future research.
The water channel AQP4 has been reported to play a central role in the functionality of the glymphatic system and consequently in brain water homeostasis and health. Following the recent discovery of AQP4 expression in human body donor CPECs, the new culture models were subsequently used for first investigations of regulatory mechanisms behind this phenomenon. Comparing AQP4 expression on CPECs cultured on laminin, a coating known to induce AQP4 clustering in astrocyte cultures, we observed no difference to the expression pattern on collagen coating. Another possible mechanism that may induce AQP4 in CPECs is hypoxia, as previous studies found AQP4 expression in CPECs of hypoxia treated mice. CP tissue undergoes age-related changes, which include stromal fibrosis and a subsequently enlarged diffusion pathway, which are even more pronounced in AD. Subsequently, CPECs may experience oxygen deficits in these tissues. Investigating the effect of hypoxic conditions on the AQP4 expression in human CP explant cultures, we observed increased AQP4 intensity after 5 days of hypoxia treatment and cell counts revealed a significantly increased number of AQP4-positive cells compared to the control group. However, repeating the hypoxia experiments in cultures obtained from another body donor did not show a statistically significant difference, providing overall no definite effect of hypoxia treatment. It should be noted that we faced several challenges during cell counting. Firstly, there was substantial variability in the initial AQP4 levels between regions and body donors. We attempted to minimize this effect by splitting explant culture pieces and assigning one half to the control group and the other to the hypoxia treated group. However, on a microscopical level there were still significant differences observed. Secondly, cell viability and tissue integrity varied between the pieces, resulting in areas that could not be evaluated. Finally, the intensity of the immunofluorescence signal was not considered in the cell counting. We therefore suggest that further experiments should be carried out to determine whether or not there is an effect of hypoxia on AQP4 expression in these cells. If a hypoxic state induced AQP4 expression in CPECs, this could either compensate and increase CSF production, or act as a functional leak, thereby decreasing CSF production in the ageing brain.
As a second aim of this study, an extended histological characterization of the human CP and its attachment zone was performed, providing new insights into water homeostasis in this contact zone between the CSF and the blood system. Therefore, the potential role of the DGC, a structure involved in AQP4 anchoring, was investigated by immunofluorescence staining on cryostat sections of fixed human CP tissue. In the CP epithelium, Dp staining was negative whereas DG showed a positive immunofluorescence signal that was independent of AQP4 expression in CPECs. These results, combined with the observation that laminin substrate had no effect on AQP4 expression in vitro, indicate a distinct underlying regulatory mechanism in CPECs. Interestingly, astrocytes in the Taenia choroidea showed a strongly increased and unpolarized AQP4 and Dp immunofluorescence signal whereas DG was negative. This suggests that these astrocytes also have a different AQP4 regulation than the astrocytes in the brain parenchyma. Based on these observations, we propose that astrocytes in this transition zone may play a unique role in water absorption in this region, thereby participating in the control of a functional leakage between the CP tissue and the adjacent brain tissue. Subsequently, this process may contribute substantially to the glymphatic pathway.
Dysfunction of the brain’s clearance system plays an important role in the pathogenesis of neurodegenerative diseases such as AD. It is therefore highly relevant to do further research in order to gain a deeper understanding of underlying mechanisms.
aquaporin-4