Inhaltszusammenfassung:
KV7.2 und -3 Kanäle werden hauptsächlich in neuronalem Gewebe exprimiert und stabilisieren die Zelle durch den sogenannten M-Strom im Subschwellenbereich von APs. Mutationen in KCNQ2 und -3 können u.a. zu selbstlimitierenden benignen familiären neonatalen Anfällen (BFNS) führen, können aber - wenn in sogenannten Hotspots lokalisiert - auch Ursache schwerer Verläufe wie der entwicklungsbedingten und epileptischen Enzephalopathie (DEE) sein.
Kv4 sind spannungsabhängige Kaliumkanäle, die A-Strom vermitteln. Neben der Repolarisation spielen sie eine große Rolle bei der Regulation der AP-Frequenz. Lange wurden sie vor allem mit kardialen Erkrankungen in Verbindung gebracht wie Vorhofflimmern und dem Brugada-Syndrom. KCND3 wurde erstmalig 2012 als verursachendes Gen der Spinocerebellären Ataxie Typ 19/22 identifiziert.
Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung der KCNQ2-Varianten G315R und R325G sowie der KCND3-Variante F227del.
Die elektrophysiologische Untersuchung erfolgte mittels Zwei-Mikroelektroden-Voltage-Clamp-Technik (TEVC) im heterologen Xenopus-laevis-Expressionssystem.
Die Expression der mutierten Kv7.2-Untereinheiten G315R und R325G führte zu einem vollständigen Loss-of-function (LoF). In Coexpression mit zusätzlich wildtypischer Kv7.2 α-UE (1:1) zeigte sich eine überproportionale Reduktion der Stromamplituden um > 50%, in Coexpression mit Kv7.3 α-Untereinheiten in stöchiometrisch angenommenem Verhältnis (1:1:2) eine Reduktion um mehr als 25%, was insgesamt für einen dominant negativen Effekt beider Mutationen spricht. Eine Änderung des Gatings war nicht nachweisbar. Ursächlich für den dominant negativen Effekt kann somit wegen der c-terminalen Lokalisation beider Mutationen innerhalb der Calmodulin-Bindedomäne ein gestörtes Trafficking, Tetramerisierung oder eine Funktionsstörung des Gesamtkanals bei Integration einer dysfunktionalen α-Untereinheit sein.
Die Expression der mutierten Kv7.2-Kanäle führte zudem zu einer deutlichen Depolarisation des Ruhemembranpotenzials um etwa 30 mV. Auch bei Coexpression mit wt Kv7.2 bestand eine Restdepolarisation von 7–14 mV. Dass eine Depolarisation bei reifen Neuronen mit einer erhöhten Exzitabilität und erhöhter Anfallsbereitschaft einhergeht, ist in früheren Studien mehrfach nachgewiesen worden. Dass in unreifen Zellen eine Depolarisation des RMP eine Störung der neuronalen Reifung und Netzwerkbildung bewirken kann, ist Gegenstand jüngerer Studien. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Verschiebung des RMP in Richtung Depolarisation unterstreicht eine mögliche Auswirkung auf Zelldifferenzierung, neuronale Entwicklung und Entstehung einer DEE neben der erhöhten Anfallsbereitschaft peri- und postnatal.
Unter Retigabin (10 µM) zeigte sich sowohl bei Wildtyp- als auch bei mutierten Kv7.2/Kv7.3-Kanälen eine Verschiebung des Strom-Spannungs-Verhältnisses in Richtung hyperpolarisierter Membranpotenziale. Bei G315R war der Shift mit −22 mV stärker ausgeprägt als bei Wildtyp und R325G (je −12 mV). Erklärend könnte die Nähe der Mutation zur Retigabin-Bindestelle und der Austausch der kleinen Glycin-Seitenkette gegen eine große, positiv geladene Arginin-Gruppe mit möglicherweise erhöhter pharmakologischer Zugänglichkeit der RTG-Bindungstasche sein. Zusammenfassend konnte somit experimentell eine pharmakologische Erreichbarkeit durch RTG trotz ausgeprägtem dominant negativen Funktionsdefekt nachgewiesen werden.
Die Kv4.3-Variante F227del führte ebenfalls zu einem vollständigen LoF. Auch die Coexpression mit Wildtyp-Kv4.3 konnte keinen messbaren Strom wiederherstellen.
Wie durch eine vorherige Studie immunhistochemisch nachgewiesen (Lee et al., 2012) ist dies durch eine gestörte Faltung und Trafficking bedingt und nicht durch eine Veränderung des Gatings trotz Mutationslokalisation in der Spannungssensordomäne S2. Eine Erklärungsmöglichkeit könnte sein, dass die Deletion der neutralen, unpolaren Aminosäure eine Störung der Helixgeometrie und Hydrophobizität verursacht und somit den Einbau in die Plasmamembran verhindert (Lee et al., 2012).
