Parapockenvirus ORF-Virus D1701: Attenuierung und Herstellung einer Vektorvakzine gegen die Borna´sche Krankheit

Abstract

Der Prototyp des Genus Parapockenvirus (PPV) ist das Orf Virus (ORFV), welches in seinem natürlichen Wirt (Schaf, Ziege) ulzerative Hautläsionen (Ecthyma contagiosum) hervorruft. Um das ORFV als viralen Vektor verwenden zu können wurden nicht-essentielle Gene im Virusgenom identifiziert, die als Insertionsorte für Fremdgene genutzt werden sollten. Der interessanteste Kandidat war das vegf-e Gen. Es konnte gezeigt werden, dass sich im attenuierten ORFV-Stamm D1701 die bakteriellen Gene lacZ und Xgpt im vegf-e Locus inserieren und exprimieren ließen und mittels lacZ/Xgpt Selektion rekombinante D1701 Viren isoliert werden konnten. Im Gegensatz zu anderen Pockenviren besitzen die PPV ein sehr enges Wirtsspektrum. Immunmodulatorische ORFV Proteine erleichtern die lokale Infektion und verhindern die Induktion einer lang anhaltenden Immunantwort des Wirtes gegenüber ORFV. Diese immunmodulatorischen Gene erhöhen somit die Virulenz des Viruses. Durch Eliminierung solcher Virulenzgene, wie z.B. des viralen vegf-e oder des GIF Gens von ORFV D1701 erfolgte eine zusätzliche Attenuierung. Die in dieser Arbeit hergestellten unterschiedlichen ORFV Rekombinanten zeigten, dass Deletionen im Genom des in Vero-Zellen adaptierten ORFV-Stammes D1701-V zum gleichen apathogenen Phänotyp führten wie nach Deletion des vegf-e Gens. Das Potential einer auf D1701-V basierenden Vektorvakzine wurde im für ORFV nicht-permissiven Rattenmodell der Borna Disease Virus (BDV) Infektion überprüft. Hierzu wurde das p40 Nukleoprotein von BDV erfolgreich in das ORFV Genom an Stelle des vegf-e Gens inseriert und Ratten mit der Rekombinanten D1701-VrVp40 (Dp40) nach unterschiedlichen Protokollen immunisiert. Eine dreimalige intramuskuläre Immunisierung mit je 107 pfu Dp40 induzierte eine sehr gute, lang anhaltende Immunantwort gegen BDV und die Tiere waren gegenüber einer BDV-Belastungsinfektion vollständig geschützt. Darüber hinaus führte die Immunisierung zu einer deutlichen Virusreduktion in den Gehirnen der immunisierten Tiere nach BDV-Infektion bis hin zur Eliminierung von nachweisbarem BDV. Immunhistochemische Analysen zeigten eine große Anzahl CD45RC+ Lymphozyten, B-Zellen, Immunglobuline und CD8+ Microglia-Zellen in Assoziation mit BDV-infizierten Neuronen in den Gehirnen der immunisierten und infizierten Tiere, die in den Gehirnen der Kontrolltiere nicht auftraten. Die Immunisierung mit Dp40 scheint eine ausgeglichene TH1/TH2 Immunantwort gegen BDV zu vermitteln, wodurch erstmals durch eine Lebendschutzimpfung eine Immunpathogenese durch BDV-spezifische cytotoxische T-Zellen verhindert wurde. Mechanismen dieser nicht-zytolytischen, schützenden Immunantwort nach Applikation der ORFV-Rekombinanten bleiben weiter zu klären.

Zusammenfassend zeigten die Experimente den erfolgreichen Einsatz dieses neuen ORFV Vektorsystems in einem Wirt, der keine Replikation des Vektorvirus erlaubt und somit ein entscheidendes Sicherheitskriterium erfüllt. Weiterhin erlaubt die kurzlebige Immunität gegen ORFV Mehrfachimmunisierung mit ORFV-Rekombinanten und schließlich lassen sich die rekombinanten ORFV unter kontrollierbareren Bedingungen produzieren als andere nicht-replizierende Pockenvirusvektoren.

The Orf virus (ORFV) represents the prototype species of the genus Parapoxvirus (PPV) and infection of its natural host (sheep and goat) causes a contagious pustular dermatitis (contagious Ecthyma). For the use of ORFV as a viral vector non-essential genes were detected within the viral genome suitable as insertion sites for foreign genes. The most interesting candidate was the vegf-e gene. The bacterial genes lacZ and xgpt could be inserted into the vegf-e locus and expressed in the attenuated ORFV D1701 and lacZ/xgpt selection allowed the generation of recombinant D1701 viruses. In contrast to other poxviruses the PPV contain a very restricted host range. Immune modulating ORFV proteins facilitate local infection of the host and prevent a long lasting immune response of the host against ORFV. Thus, immune modulating proteins increase virus virulence. Deletion of those virulence genes (like the viral vegf-e or GIF) resulted in additional attenuation of ORFV D1701. Furthermore, the different ORFV recombinants described in this thesis demonstrated that deletions in the genome of Vero cell-adapted strain D1701-V resulted in a similar apathogenic phenotype as after deletion of the vegf-e gene.

The potential of a D1701-V based vector vaccine was proven in rats, which are non-permissive for ORFV and represent an excellent model for Borna disease virus (BDV) infection. The p40 (N) nucleoprotein of BDV was inserted in the vegf-e gene locus and the resulting D1701-VrVp40 recombinant (Dp40) was used for immunisation of rats. A threefold intramuscular application of 107 pfu Dp40 resulted in an excellent, long lasting immune response against BDV and mediated complete protection against BDV challenge infection. Moreover, the immunisation reduced the virus in the brain of immunised animals after BDV challenge up to the point of elimination of detectable BDV.

Immunohistochemical analyses illustrated a close association of numerous CD45RC+ lymphocytes, B-cells, immunoglobulin and CD8+ microglia cells with BDV infected neurons in the brain of immunized and infected rats, which were not seen in the brain of control animals. The data indicate that the immunization with Dp40 mediates a balanced TH1/TH2 immune response. For the first time, a life vaccination could prevent the immunopathogenesis caused by BDV-specific cytotoxic T-cells. Underlying mechanisms of the Dp40-induced non-cytolytic protective immunity remain to be solved. In conclusion, the presented experiments demonstrate the successful use of the novel ORFV vector system in a host that does not support the replication of the vector virus, which is important for safety reasons. Additionally, the short-term ORFV immunity will allow multiple applications of recombinant ORFV vaccines, and finally the possibility of economic production of ORFV under controlled conditions is superior to other non-replicating pox viruses.