Analyse der Wirkmechanismen antibakterieller Substanzen in Pasteurellaceae.

Abstract

Pasteurella multocida und Mannheimia haemolytica sind gram negative Bakterien der Familie Pasteurellaceae, die eine weltweit verbreitete und ökonomisch wichtige Erkrankung bei Rindern, die Enzootische Bronchopneumonie, verursachen. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Expressionsprofile von diesen beiden Erregern nach der Behandlung für 10 bzw. 30 min mit acht unterschiedlichen Antibiotika (Novobiocin, Enrofloxacin, Florfenicol, Tilmicosin, Cefquinom, Rifampicin, Trimethoprim und Brodimoprim), bildete ein bis dato einzigartiges Referenzkompendium zur Erforschung des MoAs einer antibiotischen Substanz mit unbekannten MoA (Thiazin). Ferner bildete dieses Referenzkompendium eine Grundlage für die Charakterisierung der Expressionsprofile des halbsynthetischen Naturstoffes C-30 mit vermuteter Virulenzabschwächender Wirkung. Die für die microarray Auswertung eingesetzte optimierte Datenbearbeitung beinhaltete eine globale cluster-Analyse, eine fingerprint-Analyse, die Ermittlung der genomweiten Genregulation und der Regulation der Expression der Zielgene, sowie die Identifikation von Antibiotika spezifischen Signaturgenen. Zur Übersichtlichkeit der Auswertung und der Erörterung der Ergebnisse wurde ein Schwerpunkt auf die Expressionsprofile von P. multocida gelegt. Mittels cluster-Analyse wurden die P. multocida Expressionsprofile in fünf cluster eingeteilt, wobei die Antibiotika mit ähnlichen MoA, mit Ausnahme von Enrofloxacin und Cefquinom, separate Gruppen bildeten. Enrofloxacin und Cefquinom verursachten einen geringen Effekt auf das Transkriptom von P. multocida, wobei nur etwa 1 % des Genoms beeinflusst wurde. Hingegen wurden 20 % des Genoms durch die restlichen getesteten Antibiotika Florfenicol, Tilmicosin, Rifampicin, Trimethoprim und Brodimoprim reguliert. Novobiocin wirkte außergewöhnlich stark und regulierte 40 % des P. multocida Genoms. Eine Regulation der Zielgene wurde bei Novobiocin (DNA Gyrase), Rifampicin (RNA Polymerase), Florfenicol (Ribosom) und Tilmicosin (Ribosom) festgestellt. Die Inhibitoren der Folatbiosynthese (Trimethoprim und Brodimoprim), der Inhibitor der DNA Gyrase (Enrofloxacin) und der Inhibitor der Zellwandbiosynthese (Cefquinom) verursachten dagegen keine Regulation der Zielgene. Die Signaturgene, die durch einzelne Antibiotika spezifisch reguliert worden waren, wurden für alle untersuchten Antibiotika identifiziert. Die Aufnahme der Expressionsprofile zweier eng verwandter Bakterien zielte auf die einzigartige Möglichkeit, durch Vergleich der Regulation orthologer Gene, Hinweise auf den MoA einer neuen Substanz zu bekommen. Es zeigte sich allerdings, dass zum Teil große Unterschiede in der transkriptionellen Antwort beider Bakterien auf Antibiotika-Behandlung existieren, die zur Vorsicht bei einer vergleichenden MoA Analyse mahnen. Die Transkription vieler Virulenzgene, insbesondere solcher, die in Kapselbiosynthese und Kapseltransport, LPS Biosynthese, Kompetenz, Adhärenz und Eisenaufnahme involviert sind, wurde durch die Antibiotika beeinflusst. Dabei wurde die Expression generell reprimiert. Das lässt vermuten, dass der therapeutische Effekt der Antibiotika auf einer Kombination von Wachstumshemmung und Virulenzabschwächung beruht. Novobiocin und Trimethoprim verursachten eine deutliche Reprimierung der Kapselgene von P. multocida, was in der Tat zu einer reduzierten Ausbildung der Kapsel führte. Für Florfenicol konnte allerdings kein Zusammenhang zwischen Kapselgenregulation und Verringerung der Kapsel gezeigt werden. Mit Hilfe des Referenzkompendiums wurden die Thiazin-induzierten Expressionsprofile von M. haemolytica und P. multocida untersucht. Thiazin ist eine antibiotisch hochwirksame Substanz für Pasteurellaceae, deren Wirkmechanismus noch nicht bekannt ist. Die Thiazin-induzierten Expressionsprofile in M. haemolytica und P. multocida führten nicht zu konkreten Hinweisen auf das Zielprotein oder die Zielproteine. Allerdings lässt die Tatsache, dass die Thiazin-induzierten Expressionsprofile keine Ähnlichkeiten zu den Expressionsprofilen des Referenzkompendiums zeigten, auf einen neuen Wirkmechanismus schließen. Zu den möglichen Kandidaten für das Zielprotein oder die Zielproteine von Thiazin wurden die 18 orthologe Gene, die in beiden Bakterien induziert wurden, gezählt. Diese globale Transkriptom-Analyse stellt nur einen ersten Schritt dar, der durch biochemische und molekularbiologische Studien begleitet werden muss. Die Wirkung von C-30, einem halogenierten Furanon, wurde ebenfalls untersucht. Dabei zeigte sich, dass C-30 die Transkription einer ähnlichen Anzahl von Virulenzgenen beeinflusste, wie die Substanzen des Referenzkompendiums. Von 165 potentiellen P. multocida Virulenzgenen wurden 23 durch C-30 (10 µM) reguliert. Darunter waren Gene, die für die Protease ClpB und die Katalase HtkE kodieren, sowie zwei weitere Gene aus dem Eisentransportsystem (exbB und exbD).

Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica are gram negative bacteria of the family Pasteurellaceae. Both are the causative agents of bovine respiratory disease, a highly contagious infection, which causes significant economic losses to beef industry worldwide. The transcriptional response of P. multocida and M. haemolytica to eight antibiotics with known mode of actions (MoAs) was recorded to create a compendium of transcriptional profiles for MoA studies. Data analysis included the identification of regulated genes, a global cluster and fingerprint analysis, as well as the identification of antibiotic-specific signature genes and altered virulence genes. Furthermore, the compendium of transcriptional profiles was compared with the profiles of two substances with unknown MoA. A thiazin antibiotic and a furanone virulence factor inhibitor were investigated. The data analysis focused mainly on the P. multocida reference compendium. At minimal inhibitory concentration the three bactericidal compounds enrofloxacin, cefquinome and the novel thiazin compound had a minor impact on gene regulation with approximately 1 % of the P. multocida genome affected, whilst the bacteriostatic compounds florfenicol, tilmicosin, rifampin, trimethoprim and brodimoprim regulated approximately 20 % of the genome. The bacteriostatic antibiotic novobiocin was particular by regulating 40 % of all P. multocida genes. Regulation of target genes was observed for novobiocin, rifampin, florfenicol and tilmicosin and signature genes were identified for all antibiotics. Comparative analysis of gene expression between two related bacteria family Pasteurellaceae is a powerful method to draw conclusions about the distinctive as well as similar characteristics between these species. The reference compendium for P. multocida and M. haemolytica represents the unique basis for the MoA determination of new antimicrobial compounds. Comparing the transcriptional response between these two bacteria revealed the differences of global expression profiles and also differences in the alterations of orthologous genes expression. These results helped to elucidate the MoA of potential antimicrobial drug candidate thiazin. The transcription of many P. multocida virulence factors, particularly genes involved in capsule synthesis and export, LPS synthesis, competence, adherence and iron transport was altered in the presence of antibiotics. Virulence gene transcription was mainly negatively affected, however also the opposite effect was observed, like the up-regulation of the tad locus involved in tight adherence by rifampin. Novobiocin and trimethoprim caused a strong decrease in the transcription of capsule genes, which correlated with a concomitant reduction of the capsular layer on the surface of P. multocida. The broad negative impact on virulence gene transcription supports the notion that the therapeutic effect of some antibiotics could be a combination of growth and virulence inhibition. The thiazin compound is a new anti-infective compound against Pasteurellaceae and the MoA of this compound is unknown. In both bacteria P. multocida and M. haemolytica the thiazin induced transcriptional profiles were unrelated to the reference compendium profiles pointing to a new MoA. In both bacteria 18 orthologous genes were induced by thiazin. Following the notion that target genes often are induced upon an antibiotic assault, these upregulated genes could represent possible target proteins. However the global transcriptome analysis represents a first step to determine the MoA of new compounds which must be followed by biochemical and genetic studies. The effect of the furanone C-30 was also analyzed. The transcription of a similar number of virulence genes was altered by C-30 as compared to the antibiotics of the reference compendium. For instance in case of P. multocida the expression of 23 virulence genes was regulated by 10 µM C-30 after 10 min. These genes code for a ClpB protease and HtkE Katalase, as well as for two proteins of iron uptake system (exbB and exbD).