Untersuchungen zur Autophagie bei Trypanosomen unter besonderer Berücksichtigung von autophagierelevanten Proteinen und deren in vivo-Kristallbildung

Abstract

Die afrikanische Schlafkrankheit ist trotz jahrzehntelanger Bemühungen zur Bekämpfung der Parasiten nach wie vor eine existenzielle Bedrohung für die Menschen und Nutztiere der betroffenen Regionen in Afrika. Aktuell verfügbare Therapiemöglichkeiten basieren auf veralteten Medikamenten, welche eine hohe Toxizität aufweisen und für die betroffene Bevölkerung nicht bezahlbar sind. Neue, effektive und bezahlbare Medikamente sind dringend nötig, auch als Beitrag zur nachhaltigen Verbesserung der sozialen und wirtschaftlichen Bedingungen der betroffenen Menschen. Ein Ansatzpunkt ist der Eingriff in die für das Überleben des Parasiten essentielle Differenzierung während seines Lebenszyklus, bei welcher autophagische Prozesse eine große Rolle spielen. Über die Rolle der Autophagie bei Trypanosomen ist bisher wenig bekannt, aber genomische Untersuchungen legen nahe, dass Trypanosomen eine primitivere Form der Autophagie, verglichen mit den höheren Eukaryonten, aufweisen. Nähere Untersuchungen der beteiligten Proteine können einen notwendigen Beitrag zum Verständnis dieses für den Parasiten kritischen Prozesses darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur von ATG8 aus Trypanosoma brucei (TbATG8), ein wichtiges ubiquitin-ähnliches Markerprotein für autophagische Prozesse, bestimmt. Die Struktur von TbATG8 bildet eine charakteristische Ubiquitin-Faltung aus und zeigt insgesamt eine große Ähnlichkeit zu den bekannten Strukturen der Ubiquitin-like modifier (Ubl) aus höheren Eukaryonten, was darauf hindeutet, dass dieser Teil der Autophagie in struktureller Hinsicht bereits in diesen evolutionsgeschichtlich sehr alten Einzellern konserviert vorliegt. Mit dieser ersten Struktur eines Autophagieproteins aus Protozoen wurden ferner Interaktionsmöglichkeiten mit der zugehörigen Protease TbATG4 untersucht. Auch hier ergab sich, dass eine ähnliche Komplexbildung aus TbATG8 und TbATG4, wie in den höheren Eukaryonten, möglich ist. Dennoch weisen die homologen ATG4-Proteine gegenüber dem humanen ATG4 eine Deletion eines Sequenzbereichs auf, welche für die Entwicklung z.B eines Inhibitors interessant sein kann. Für die Autophagie ebenfalls relevant sind die lysosomalen Proteasen, denen neben der Prozessierung autophagierelevanter Proteine, hauptsächlich beim Abbau des Zellmaterials eine große Bedeutung zukommt. Besonders interessant für die Entwicklung von Inhibitoren ist hier das cathepsin-B like protein aus Trypanosoma brucei (TbCatB), eine Cysteinprotease welche essenziell für das Überleben des Erregers im Blut des Menschen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein zunächst im bakteriellen Expressionsystem E.coli exprimiert, wobei trotz verschiedener Proteinkonstrukte auf diesem Wege nicht ausreichend lösliches rekombinantes Protein gewonnen werden konnte. Daher wurde das Protein anschließend mit dem eukaryotischen Baculovirus-Expressionssystem in SF9-Insektenzellen exprimiert. Bei der Überexpression der Preproform von TbCatB zeigten nadelförmige Mikrostrukturen innerhalb der Insektenzellen, welche im Folgenden als Proteinkristalle identifiziert werden konnten. Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen konnte die Morphologie und Lokalisation näher bestimmt werden. Die Kristalle ließen sich in ersten Pilotexperimenten nicht direkt für eine Strukturaufklärung mit Synchrotonstrahlung verwenden und so wurde eine Methode entwickelt, die Kristalle aufzureinigen und zu resolubilisieren. Für das resolubilisierte Protein konnte eine Cathepsin B-Aktivität nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Kristalle das rekombinante TbCatB in zwei Formen unterschiedlicher Glykosylierung enthalten. Enzymatisch deglykosyliertes Protein konnte anschließend erfolgreich für eine Rekristallisierung und Strukturaufklärung eingesetzt werden. Die Struktur von TbCatB zeigt im Vergleich zum humanen Cathepsin B Unterschiede im Bereich der Bindetasche und kann daher verwendet werden, um die Spezifität von Inhibitoren zu verbessern. In einem weiteren Experiment konnte anhand von TbIMPDH gezeigt werden, dass die in dieser Arbeit untersuchte neue Form intrazellulärer Kristallbildung nicht nur auf ein Protein beschränkt ist, und auch Proteine anderer Funktion und Lokalisierung solche in vivo-Kristalle in Insektenzellen bilden können.

Human african sleeping sickness (HAT) represents still a major threat to many people and cattle in Africa today, despite much effort has been made in fighting the causative parasites, the trypanosomes. The current therapies are based on outdated and toxic compounds which are not affordable for the affected people. There is a need for new effective and low-cost compounds also as a contribution to improve the social and economical conditions for the african people.Interference with differentiation and closely linked autophagic processes which are essential for the survival of the parasite could represent a new starting point to fight the disease. Autophagy in trypanosomes is poorly understood up to now, though genomic analysis point towards a rudimentary type of autophagie compared to higher eukaryotes. Further investigation of the relevant proteins could lead to a better understanding of this critical process. During this investigation the crystal stucture of ATG8 from Trypanosoma brucei (TbATG8), an important ubiquitin-like markerprotein for autophagic processes could be determined. The structure shows a characteristic ubiquitin-folding and generally exhibit high similiarity to structures of the ubiquitin-like modifiers (ubl) from higher eukaryotes which indicates structural conservation of this part of autophagy in these ancient unicellular organism. Due to its characteristic folding, it should readily bind to TbATG4.1 for being processed. This presumption was tested by molecular modeling approaches, docking TbATG8B to a homology model of TbATG4.1. Although exchanges of several amino acids are evident from sequence comparisons, the overall structure seems very much alike and the necessary catalytic triad (C-D-H) is well conserved in TbATG4.1. Thus membrane formation during appearance of the autophagic bodies seems very similar in trypanosomes and their higher eukaryotic counterpart. Cysteine proteases and their function for protein degradation in the lysosomes possess also significant relevance for autophagic processes. The cathepsin-B like protein from Trypanosoma brucei (TbCatB) is of particular interest as it is essential for the survival of the parasite and represents therefore a validated drug target. Within this study the protein was cloned and expressed with the baculovirus-system in Sf9-insect cells. Thereby needleshaped microstructures could be observed, which could be identified as intracellular protein crystals. These in vivo-crystals were then further characterized by electron microscopy. Crystals were resolubilised and successfully used for recrystallization. These crystals could be used for structure determination. Structure of TbCatB show typical Cathepsin B-folding with differences in the proregion and in the S2-binding pocket compared to the human counterpart. This could be used in future development and optimization of specific inhibitors. In another experiment with the TbIMPDH-protein it could be shown, that this new way of intracellular crystal formation is not limited to only one protein and also proteins of different function and localization could form such in-vivo crystals in insect cells.