Solid-phase syntheses and studies of conformationally constrained analogues of the calcitonin gene peptide superfamily polypeptides calcitonin (Ct) and islet amyloid polypeptide (IAPP)

Abstract

Conformationally constrained analogues of natively occuring bioactive polypeptides are valuable tools for the understanding of their structure-function-relationships and for the design and development of lead structures with therapeutic and diagnostic applications. The work described in this thesis focuses on the application of conformational constraints on two polypeptides from the calcitonin gene peptide "superfamily": the calcium- and bone-turnover-regulating hormone calcitonin (Ct) and the carbohydrate metabolism-regulating hormone islet amyloid polypeptide (IAPP). These two, 32 and 37, respectively, residue polypeptides have a common genetic origin and exhibit some primary sequence homology and overlapping biological activities and receptor cross-reactivities. Towards this goal, twenty five hCt analogues bearing a cyclic conformational constraint and/or several substitutes for residues in region 17 to 21 that was postulated to be important for bioactivity were designed. The analogues were synthesized in good yields and purity by solid phase (SPPS) synthetic protocols using the Boc- and/or the Fmoc- strategy in combination with special side chain protection strategies for the side chain-to-side chain cyclization on the resin. Following purification by RP-HPLC and characterization by mass spectrometry, their binding affinities to the Ct-receptor and their AC activation potencies were investigated using the T47D cell line. Conformational restriction via a rational introduction of N-methyl rests in amide bonds of short, b-sheet-forming, amyloidogenic sequences has been very recently suggested to be a reasonable strategy to delineate the structure-amyloidogenicity-cytotoxicity relationships of such sequences and convert amyloid-forming sequences into non-amyloidogenic and non-cytotoxic ones. The second part of the thesis describes in detail the SPPS of the (human) IAPP sequence, of the strongly amyloidogenic IAPP mutant S20G-IAPP, and of five IAPP analogues that have been conformationally constrained via N-methylation of amide bonds. In addition, first studies on the effect of the selective introduction of N-methyl rests on the b-sheet-forming potential and the cytotoxic properties of one representative N-methylated IAPP analogue as compared to the natively occuring IAPP sequence are presented. Taken together, the results of this work showed that restriction of conformational flexibility of medium-sized bioactive polypeptides can yield valuable information about the structure-activity-relationships and contribute to the design of potent agonists (hCt analogues) or analogues with an altered or completely different biophysical profile as compared to the natively occuring polypeptides (IAPP analogues). In addition, the results of this work suggest that the conformational restriction strategy may be applicable to other polypeptides sequences too, including longer sequences or other amyloidogenic ones. This work also showed that the SPPS of N-methylated and aggregation prone polypeptide sequences is still a formidable synthetic task.

Konformationell eingeschränkte Analoga von nativ-vorkommenden bioaktiven Polypeptiden sind wichtige Werkzeuge, welche der Aufklärung von Strukturaktivitäts-Beziehungen dienen und beim Design und der Entwicklung von Leitstrukturen mit therapeutischen und diagnostischen Anwendungen Einsatz finden können. In der hier vorgelegten Doktorarbeit wurden Konformationsrestriktionen auf zwei Polypeptide aus der Calcitonin-Gen-Peptid-Familie, das Calcium- und Knochenstoffwechsel-regulierende Hormon Calcitonin (Ct) und das Kohlenhydratmetabolismus-regulierende Hormon Islet Amyloid Polypeptid (IAPP) angwendet. Diese zwei, aus 32 bzw. 37 Aminosäure bestehenden, Polypeptide haben eine gemeinsame genetische Herkunft und weisen zum Teil eine Primärstrukturhomologie sowie überlappende Bioaktivitäten und Rezeptorkreuzreaktivitäten auf. Im Hinblick auf diese Ziele wurden fünfundzwanzig hCt-Analoga designt, welche eine cyclische Konformationsrestriktion und/oder verschiedene Substituenten für Aminosäurereste in der Region 17 bis 20 enthalten, die aufgrund der Literatur für die Bioaktivität potenziell für wichtig gehalten werden konnten. Die Analoga wurden in guten Ausbeuten und guter Reinheit durch Festphasenpeptidsynthese (SPPS) mittels der Boc- und/oder der Fmoc-Strategie in Kombination mit speziellen Seitenkettenschutzstrategien für die Seitenkette-zu-Seitenketten-Cyclisierung am Harz hergestellt. Nach RP-HPLC-Reinigung und Charakterisierung mittels Massenspektometrie wurden die Ct-Rezeptorbindungsaffinitäten und Adenylatcyclaseaktivierungspotenziale der Analoga an der Brustcarcinom-Zelllinie T47D untersucht. Es wurde kürzlich vorgeschlagen, dass die Strategie der Konformationsrestriktion von kurzen b-Faltblatt-bildenden, amyloidogenen und zytotoxischen Peptidsequenzen mittels der strukturbasierten Einführung von N-Methylresten in bestimmte ausgewählte Amidbindungen eine geeignete Strategie für das Aufklären von Struktur-Amyloidogenese-Zytotoxizitäs-Beziehungen solcher Sequenzen und für die Umwandlung von amyloidogenen Peptidsequenzen in nicht-amyloidogene und nicht-zytotoxische Sequenzen ist. Der zweite Teil dieser Doktorarbeit beschreibt detailliert die Festphasenpeptidsynthesen der (humanen) IAPP-Peptidsequenz, welche aufgrund der amyloidogenen Moleküleigenschaften mehr als komplex sind. Auch die hoch-amyloidogene IAPP-Mutante S20G-IAPP, für die pathophysiologische Relevanz vermutet wird, sowie fünf, mittels N-Methylierung von Amidbindungen, konformationell-eingeschränkte IAPP-Analoga wurden in dieser Arbeit synthetisiert und dargestellt. Darüber hinaus umfasst dieser Teil der Arbeit die Ergebnisse erster Untersuchungen an einem der N-methylierten Analog zum Effekt der N-Methylierung auf das b-Faltblattbildungspotenzial und die Zelltoxizität von IAPP. Zusammenfassend haben die Ergebnisse dieser Arbeit gezeigt, dass die Restriktion der konformationellen Flexibilität von bioaktiven Polypeptiden mittlerer Länge wichtige Auskunft über ihre Struktur-Aktivitäts-Beziehungen liefern kann und zum Design von potenten Agonisten (wie hCt-Analoga) oder zu Abkömmlingen der nativ vorkommenden Polypeptidsequenz mit komplett veränderten biophysikalischen Eigenschaften (wie IAPP-Analoga) führen kann. Auch lässt sich aus den erzielten Ergebnissen ableiten, dass diese Strategie auch auf weitere Polypeptide, wie z.B. weitere amyloidogene Polypeptide oder Polypeptide größerer Länge übertragbar sein sollte. Diese Arbeit hat auch gezeigt, dass die SPPS von N-methylierten und zur Aggregation neigenden Polypeptidsequenzen noch immer ein anspruchsvolles Ziel für den Synthetiker ist, wobei in der vorgelegten Doktorarbeit wichtige Ansätze zur Optimierung solcher Synthesen erarbeitet wurden.