Programmierter Zelltod fetaler Erythrozyten

Abstract

Eryptose stellt die besondere Form der Apoptose der Erythrozyten dar, die wie die Apoptose kernhaltiger Zellen zu Phosphatidylserin-Exposition und Zellschrumpfung führt. Über durchflusszytometrische Untersuchung der Bindung FITC-markierten Annexins und des forward scatters kann dies nachgewiesen werden. Die Eryptose lässt sich in vitro durch die Entfernung von Chlorid oder Glucose aus dem Medium sowie durch Hyperosmolarität und oxidativen Stress auslösen. Hyperosmolarität und Chloridwegnahme führen durch PGE2-Bildung zur Öffnung unselektiver Kationenkanäle, was einen Calcium-Einstrom in die Zelle verursacht. Die für die Phosphatidylserin-Exposition verantwortliche Scramblase wird durch den Calcium-Einstrom aktiviert. Die Leitfähigkeit der am Ca2+-Einstrom beteiligten Kanäle kann mittels patch-clamp untersucht werden, der Calcium-Einstrom selbst wird durch Färbung mit Ca2+-sensitivem Fluo-3/AM nachgewiesen. Die unselektiven Kationenkanäle reagieren weiterhin auf oxidativen Stress (hier ausgelöst durch Zugabe von tert-Butylhydroperoxid). Hyperosmolarer Schock führt zusätzlich über PAF-Freisetzung zu Ceramid-Bildung, was die Scramblase für Calcium sensitiviert. Fetale Erythrozyten unterscheiden sich deutlich von adulten Zellen und diese besondere Erythrozytenpopulation wird bald nach der Geburt aus der Blutbahn entfernt. Diese Arbeit setzte sich zum Ziel, die Eryptose fetaler Erythrozyten zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine geringere Empfindlichkeit der fetalen Zellen gegenüber Hyperosmolarität und Chloridwegnahme. Dementsprechend wurde eine geringere Bildung sowie Empfindlichkeit gegenüber PGE2 nachgewiesen. Weiterhin konnten die vermutlich daraus resultierende geringere Kationenkanal-Leitfähigkeit und der dadurch abgeschwächte Calcium-Anstieg in der Zelle beobachtet werden. Darüber hinaus wurde auch eine geringere Empfindlichkeit gegenüber PAF festgestellt. Schließlich wurde etwas weniger spontane Ceramid-Bildung beobachtet. Andererseits sind fetale Erythrozyten empfindlicher gegenüber Glucose-Depletion und oxidativem Stress, was auch im forward scatter zu stärkerer Zellschrumpfung führt. Fetale Erythrozyten zeigen somit wie adulte Zellen Eryptose, wobei je nach Stimulus eine geringere oder höhere Resistenz beobachtet wurde. Diese Ergebnisse liefern einen möglichen Erklärungsansatz für die Trimenonreduktion und die Anämie des Frühgeborenen.

Eryptosis or apoptosis-like death of erythrocytes is characterized by phosphatidylserine exposure and erythrocyte shrinkage, both typical features of nucleated apoptotic cells. Eryptosis is triggered by activation of non-selective Ca2+-permeable cation channels with subsequent entry of Ca2+ and stimulation of Ca2+-sensitive scrambling of the cell membrane. Apart from increased cytosolic Ca2+ activity enhanced ceramide levels also lead to membrane scrambling with subsequent phosphatidylserine exposure. Eryptosis is triggered by Cl- removal, osmotic shock, oxidative stress or glucose deprivation. Fetal erythrocytes show distinctive characteristics. Postpartum they are rapidly cleared from the peripheral blood-stream. The present work compares susceptibility to eryptosis in fetal and adult erythrocytes. Channel activity was determined utilizing patch clamp, cytosolic Ca2+ activity by Fluo3 fluorescence, phosphatidylserine exposure by FITC-labelled annexin-V binding, and cell shrinkage by decrease of forward scatter in FACS analysis. PGE2 formation, cation channel activity, Ca2+ entry, annexin-V binding and decrease of forward scatter were triggered by removal of Cl- in both, adult and fetal erythrocytes. The effects were, however, significantly blunted in fetal erythrocytes. Osmotic shock, PGE2 and PAF similarly increased annexin V binding and decreased forward scatter, effects again significantly reduced in fetal erythrocytes. On the other hand, spontaneous and oxidative stress (addition of tertbutylperoxide)-induced eryptosis was significantly larger in fetal erythrocytes. Eryptosis triggered by glucose deprivation was enhanced in fetal erythrocytes. Ceramide formation seems to be less apparent in fetal erythrocytes, albeit there was no significant difference. In conclusion, cation channel activity, Ca2+ leak and thus channel-dependent triggering of eryptosis are blunted, whereas spontaneous, oxidative stress- and glucose deprivation-induced eryptosis is more pronounced in fetal erythrocytes. These findings render possible explanations for the physiological anemia of the newborn and the anemia of prematurity.